Fondation, procédure et utilisations du test coagulase

La Test de coagulase Il s'agit d'une technique de laboratoire qui est utilisée pour mettre en évidence la présence de l'enzyme de coagulase. Cette enzyme a la propriété du plasma coagulaire. Loeb en 1903 a été le premier à décrire cette enzyme.

Ce test est effectué en coco à Gram positif, catalase positive, permettant les souches de Staphylococcus aureus du reste des staphylocoques, car il est le seul micro-organisme d'importance clinique qui le produit.

Les deux images révèlent un test de coagulase positif. Source: Image de gauche: Philippinjl [CC BY-SA 3.0 (http: // CreativeCommons.Org / licences / by-sa / 3.0 /]]. Image de droite: photo prise par l'auteur MSC. Marielsa Gil.

En ce sens, les membres de la famille de Staphylococaee qui font ce test négatif sont souvent appelés Staphylococcus coagulase négative.

Il y a des souches différentes de S. aureus  qui peut produire de la coagulase, comme Staphylococcus schleiferi spp coagulans, s. Hyicus, s. Intermedius et s. Delphini.

Cependant, les trois premiers sont d'une importance clinique au niveau vétérinaire et pouvaient rarement être trouvés comme un agent causal des infections humaines, tandis que S. Delphini On ne trouve que dans les environnements marins.

De plus, ils diffèrent facilement parce que S. Hyicus et S. Intermédiaire Ils ne fermentent pas le mannitol et S. Schleiferi spp coagulans ne fermente pas le maltose, ni le trehalosa, tandis que S. aureus Oui fermenter ces glucides.

La présence de l'enzyme coagulase a été liée à la virulence des souches.  Cependant, cette théorie a chuté, compte tenu du fait que d'autres espèces de coagulases négatives virulentes sont observées capables de produire des infections importantes.

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Base

Staphylococcus aureus Il produit deux types de coagulase, un qui reste lié à la paroi cellulaire, également appelé facteur d'agglutination ou facteur réactif de la coagulase (FRC), et un extracellulaire libéré dans les cultures liquides. C'est pourquoi ils sont appelés respectivement la coagulase unie et la coagulase libre.

L'enzyme de coagulase doit son nom à l'action qu'il produit. Cela a la capacité de transformer le fibrinogène en fibrine, créant un caillot évident lorsqu'il est en plasma, c'est-à-dire que cette enzyme simule l'activité de thrombine de la cascade de coagulation.

En fait, l'une des théories les plus acceptées est que la coagulase unie réagit avec la coagulase libre pour activer les facteurs de coagulation. Cette activation génère une substance qui agit similaire à la façon dont la prothrombine fait, créant un composé avec une fonction de thrombine.

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La différence avec la cascade normale de coagulation est que cette réaction n'a pas besoin de présence de calcium et n'est pas affectée par l'héparine.

Pour effectuer le test de coagulase, il suffit de faire face à une fraîcheur staphylococcus avec un plasma de lapin de préférence et ainsi d'observer la formation ou non du caillot.

Il existe des techniques spécifiques pour détecter la coagulase unie et la coagulase unie et gratuite en même temps.

Quelques souches de S. aureus Ils donnent un résultat positif plus rapide que les autres. La vitesse de la formation de caillots est directement proportionnelle à la concentration actuelle de coagulases.

La technique du test de coagulase dans la diapositive détecte les coagulas unies.

Procédure

-Test de coagulase dans Holder

Matériaux

-Nettoyer la feuille de diapositives

-Le plasma de lapin de préférence, le plasma humain ou cheval peut également être utilisé. Le plasma peut être acquis commercialement lyophilisé et reconstitué lorsqu'il sera utilisé ou peut être utilisé frais (récemment pris). Une autre alternative viable est l'utilisation du fibrinogène.

-Solution saline (0,85%) stérile (SSF).

Obtention d'un plasma frais

Extraire du sang veineux humain ou animal. L'un des anticoagulants suivants peut être utilisé: EDTA, oxalate de calcium, héparine ou citrate de sodium. Bien mélanger et centrifuger. Retirez aseptiquement le surnageant (plasma), sans globules rouges et déposez dans un tube stérile.

Séparation du plasma. Source: Photo prise par l'auteur: MSC. Marielsa Gil.

Plasma lyophilisé

Reconstituer comme spécifié par le kit commercial Vial.

Fibrinogène frais

À partir d'un plasma citraté, mélanger le plasma avec une solution saturée de chlorure de sodium. Laisser.

Jeter le surnageant, reconstituer le précipité jusqu'à 5 fois son volume avec de l'eau distillée stérile. Ajouter 5 unités d'héparine pour chaque ML de fibrinogène. Sauvegarder.

Technique

Dans une glissière, une goutte de solution saline et une goutte de plasma séparément sont placées. Prenez avec la poignée de platine 1 ou 2 colonies pures du micro-organisme pour essayer.

Mélanger la charge bactérienne dans la chute du plasma et répéter l'opération dans la goutte SSF. Notez les résultats immédiatement. Un résultat positif sera celui où la formation d'un agglutiné macroscopique (précipité blanc) est observé après une minute du côté de la chute avec du plasma.

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La chute de SSF sert de contrôle négatif. Si l'agglutination avec le SSF est observée, cela signifie que le micro-organisme est l'auto-aglutine, pouvoir fournir des résultats faux positifs. Dans ce cas, il doit être corroboré avec le test de tube.

Il est également recommandé de monter un contrôle positif avec une souche connue de S. aureus.   

Interprétation

Agglutination dans les 5 à 20 SEG (test positif fort).

Agglutination variable entre 20 secondes et une minute (test retardé positif).

Un certain degré d'agglutination après une minute (test douteux). Il est recommandé de répéter le test ou la confirmation par la méthode du tube.

Il n'y a pas d'agglutination (test négatif).

Résultat avec SSF. Il doit toujours donner négatif, si le résultat du test est automatiquement.

-Test de coagulase de tube

Matériaux

-Tube à essai stérile

-Plasma

-Maria Bath à 37 ° C.

Technique

Mesurez avec une pipette stérile de 0,5 ml de plasma et placez-la dans un tube à essai de 12 x 75. Chargez la poignée en platine avec 2 à 4 colonies pures pour étudier à partir d'une culture solide de 18 à 24 heures et la disparaître dans le plasma avec soin, mélanger et incuber à 37 ° C pendant 4 heures.

Examinez le tube à la première heure sans le secouer, juste incliné doucement. Si aucun caillot n'est toujours observé, vous pouvez continuer à observer toutes les 30 minutes jusqu'à terminer 4 heures. Si après 4 heures, il est toujours négatif, il peut être laissé jusqu'à 24 heures mais à température ambiante. Observer et signaler le résultat.

Sur la base de l'expérience, certains microbiologistes recommandent d'utiliser 500 µl d'une suspension bactérienne d'une culture de 18 heures dans un milieu liquide pour effectuer le test.

Apparemment, il offre des résultats plus rapides et plus fiables que lorsque les colonies de milieux solides sont émulsifiées, surtout si le plasma humain obtenu de la banque de sang a été utilisé.

L'utilisation de souches d'un bouillon aide à diluer la présence possible d'anticorps anti-staphylococciques humains dans le plasma qui peuvent inhiber l'action de la coagulase.

Interprétation

Si un caillot qui couvre tout le liquide (coagulation complète) ou le caillot que rien dans le liquide restant (coagulation partielle) ne doit être considéré comme un test positif.

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S'il n'est pas formé, c'est-à-dire que la suspension est homogène, le test est négatif.

-Test de coagulase utilisant le fibrinogène

Le fibrinogène est utilisé comme le plasma et sert à la fois pour le test du support et le test de tube. Procéder comme décrit pour le plasma et interpréter de la même manière.

Utiliser

Il est utilisé pour différencier le Staphylococcus aureus de staphylocoques coagulases négatives.

Contrôle de qualité

Avoir des cultures fraîches d'une tension de S. aureus Être utilisé comme contrôle positif. Vous pouvez également avoir une tension de S. épidermidis comme contrôle négatif.

Limites

-Un test positif ne doit pas être laissé en incubation pendant 24 heures, car S. aureus produit de la fibrinolisine qui dissout le caillot.

-Pour un test fiable, un plasma frais ou fraîchement reconstitué doit être utilisé, ainsi qu'il est important d'utiliser des cultures bactériennes fraîches (18 à 24 h). Cela évite les faux négatifs.

-Le test doit être effectué conjointement avec un contrôle négatif et un contrôle positif.

-Certains supports solides peuvent interférer avec le test de coagulase. Ce n'est pas recommandé.

-Si un plasma citraté est utilisé, il est recommandé de placer 5 unités d'héparine par ml de plasma pour éviter les faux positifs. C'est parce que certains micro-organismes différents de S. aureus Ils peuvent décomposer le citrate et faire du caillot de plasma. Dans ce cas, il est conseillé de faire du Gram et un test de catalase.

-Il est important, dans le test du tube, surveille la réaction toutes les 30 minutes, car il y a des souches de S. aureus qui produisent des concentrations élevées de fibrinolisine et dilueront le caillot nouvellement formé. Évitez les faux négatifs.

-Lors de la surveillance du test, le tube doit être évité brusquement, cela peut détruire le début de la formation du caillot qui ne sera pas restauré, provoquant des faux négatifs.

Les références

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