Méthode Bradford Qu'est-ce que, Principe, réactifs, utilise

Il Méthode Bradford Il s'agit d'une méthode colorimétrique actuellement utilisée pour une estimation rapide de la concentration totale de protéines dans des échantillons d'expérimentation biologique. Il est utilisé dans de nombreux domaines de recherche biologique, médicale, vétérinaire et agronomique, etc.

Il est connu sous le nom de «méthode Bradford» parce qu'il a été décrit pour la première fois par Marion Bradford en 1976, dans sa publication intitulée Une méthode rapide et sensible pour la quantification des protéines dans des quantités de microgrammes utilisant le principe de l'union protéique-youth.

Photographie d'une plaque ELISA où les échantillons se sont préparés pour une quantification de Bradford (Source: Helito, CC BY-SA 4.0, via Wikimedia Commons)

Depuis sa proposition, cette méthode a été populaire, car elle est reconnue plus sensible que les autres méthodes de quantification des protéines (telles que Lowry et Biuret, par exemple); une forme complexe plus stable et est économique et facile à réaliser.

De plus, il a été démontré que les réactifs qu'ils utilisent ont très peu d'interférence dans les mesures spectrophotométriques dans différentes conditions.

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Principe de la méthode

La méthode de Bradford est basée sur la quantification des changements de couleur dans une solution due à l'Union - dans des conditions acides - des molécules protéiques d'un échantillon avec les molécules d'une teinture spéciale: Coomassie Blue Bleu brillant G250.

Lorsque ce colorant est ajouté à une solution de protéines, il se lie à ces molécules à travers les forces électrostatiques et cette réaction est mise en évidence comme un changement de couleur brun rougeâtre en bleu en bleu.

Protéines et acides aminés

Tout comme le corps est formé par de nombreuses cellules et les acides nucléiques (tels que l'ADN et l'ARN) sont formés par des nucléotides, les protéines sont formées par des séquences ordonnées de certaines molécules appelées acides aminés.

Un acide aminé est une molécule composée d'un atome de carbone central auquel 4 groupes chimiques différents sont joints: un atome d'hydrogène, un groupe carboxyle, un groupe amino et une chaîne de groupe ou latérale, ce qui donne l'identité.

Il y a 20 acides aminés communs pour toutes les protéines, qui diffèrent les uns des autres par rapport aux propriétés de leurs groupes secondaires: il existe des acides aminés de base, des acides, polaires, apolaires, cycliques, aromatiques, etc.

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La somme des caractéristiques de ces acides aminés et l'ordre dans lequel ils se joignent pour former la structure des protéines donne à chaque protéine une série de caractéristiques physicochimiques particulières, que ce soit en ce qui concerne leur charge, leur masse, leur hydrophobicité, entre autres.

Complexe de protéines de teinte

La méthode de Bradford quantifie donc la présence de résidus d'acides aminés des caractéristiques de base dans les échantillons biologiques, en particulier les acides aminés tels que l'arginine, la lysine et l'histidine, qui sont ceux qui sont plus facilement accueillis avec Coomassie Blue.

Les changements de couleur sont quantifiés sous forme de variations dans l'absorbance des échantillons, qui est mesurée à l'aide d'un spectrophotomètre ajusté à une longueur d'onde de 595 nm.

Qu'est-ce que l'absorbance?

Il est également connu sous le nom de densité optique et définit la quantité de lumière absorbée par une solution. Cette absorption dépend de la longueur d'onde de la lumière utilisée pour irradier la solution, car toutes les molécules ne sont pas capables d'absorber la même longueur d'onde.

Ce phénomène a été résumé dans une loi connue sous le nom de loi de Beer-Lambert, qui établit la relation entre la diminution de la quantité de lumière qui passe par une substance et les propriétés de ladite substance.

Por ejemplo, cuando una luz es transmitida a través de una solución se tienen dos medidas de intensidad: una intensidad incidente (antes de atravesar la solución) y una intensidad transmitida (generalmente menor, que corresponde a la fracción de luz que no fue absorbida por la solution).

La relation entre les deux valeurs est ce que l'on appelle le traitement et a des valeurs entre 0 et 1 ou est exprimée en termes de pourcentage.

L'absorbance est liée au traitement de la manière logarithmique, et la loi de Beer-Lambert propose une relation linéaire entre l'absorbance d'une solution et sa concentration, son coefficient d'extinction molaire et le coefficient optique de la solution; L'équation mathématique décrivant cette loi est la suivante:

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A (absorbance) = ε (coefficient d'extinction molaire) c (concentration) l (longueur de passe légère)

La concentration d'une solution est calculée en nettoyant ladite inconnue de l'équation et en effectuant les calculs pertinents (c = a / εl)

Qu'est-ce qu'un spectrophotomètre?

C'est un appareil qui est utilisé pour quantifier la quantité de lumière (selon la longueur d'onde) qui absorbe les molécules dans une solution ou, en d'autres termes, la quantité de lumière qu'ils passent.

Les spectrophotomètres fonctionnent en émettant un faisceau de lumière (visible ou ultraviolet) qui passe par un prisme (ou un appareil appelé monochromateur de réseau de diffraction) qui le décompose dans les différentes longueurs d'onde qui le ralentissent, permettant de "sélectionner" une longueur particulière.

Cette lumière passe par un tube spécial qui contient l'échantillon analysé et atteint par la suite un détecteur qui perçoit la quantité de lumière qui est transmise à partir de cet échantillon (qui n'a pas été absorbé) qui peut être observé plus tard grâce à un "interprète" qui A une interface graphique.

Le colorant: coomassie bleu Bleu brillant G 250

Le réactif le plus important de cette méthode est, sans aucun doute, le colorant utilisé pour "marquer" les protéines de l'échantillon. Bradford a proposé son travail parce que ce colorant existe de deux manières: un rouge et un bleu. La forme rouge devient la forme bleue une fois que le colorant se lie à une protéine, formant un complexe.

Le complexe bleu bleu-protéine a un coefficient d'extinction molaire très élevé, entraînant une plus grande sensibilité pour la quantification de la concentration de protéines dans les échantillons analysés.

Réactifs

Bien que la solution utilisée pour cette méthode de quantification soit généralement commercialisée dans des conteneurs fermés, déjà préparé - le «Bradford réactif» -, les principaux réactifs utilisés sont:

- Coomassie bleu Bleu brillant G50 (0.01% w / v)

- Acide phosphorique (8.5% W / V)

- Éthanol (4.7% W / V)

Kit de quantification des protéines par la méthode de Bradford (Source: Vivo Rolfe, CC BY-SA 4.0, via Wikimedia Commons)

Comme dans toute méthode et protocole de quantification des protéines par des méthodes spectrophotométriques, il est nécessaire d'avoir une protéine "standard" ou "standard afin d'effectuer un courbe d'étalonnage déterminer les valeurs d'absorbance liées à différentes concentrations de protéines; L'albumine sérique généralement bovine est utilisée.

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La méthode consiste à mélanger certains volumes des échantillons problème avec certains volumes du réactif de Bradford; Attendez quelques minutes pour que l'interaction colorant-protéine et le changement de couleur soient évidentes, puis mesurées et enregistrez les valeurs d'absorbance pour effectuer des calculs ultérieurs.

Utilisations / applications

La méthode de Bradford est l'une des méthodes de quantification ou d'estimation de la concentration de protéines la plus utilisée au monde, principalement en raison de son faible coût, à la vitesse à laquelle les résultats sont obtenus, à la grande stabilité entre la protéine et le colorant utilisé, pour sa reproductibilité et l'interférence minimale que les composants des réactifs utilisés pendant la mesure ont.

La méthode est utilisée dans des centaines d'applications scientifiques différentes pour la détermination des protéines dans différents contextes: physiologique, cytologique, immunologique, clinique, industrielle (en particulier dans l'industrie alimentaire), etc.

Expérimentalement, cette méthode est très utile pour:

• Surveillez la quantité de protéines contenues dans les volumes qui sont progressivement obtenus à partir d'une colonne chromatographique (dans les colonnes d'affinité, l'échange d'ions, l'absorption, la filtration du gel, entre autres) I.et. Analyser les fractions des protocoles de purification des protéines.
• Surveillez la quantité de protéine chargée dans un gel pour l'électrophorèse.
• Estimer la quantité de protéines obtenues dans un système de surexpression.

Les références

1. Bonjoch, n. P., & Tamayo, P. R. (2001). Quantification du contenu des protéines par méthode Bradford. Dans le manuel des techniques d'écophysiologie des plantes (pp. 283-295). Springer, Dordrecht.
2. Bradford, M. M. (1976). Une méthode rapide et sensible pour la quantification des quantités de microgrammes de protéine en utilisant la liaison principale du jour de la protéine. Biochimie analytique, 72 (1-2), 248-254.
3. Kielkopf, C. L., Bauer, w., & Urbatsch, je. L. (2020). Dosage de Bradford pour déterminer la concentration en protéines. Cold Spring Harbor Protocols, 2020 (4), PDB-PROT102269.
4. Sapan, C. V., Lundblad, R. L., & Price, n. C. (1999). Techniques de test de protéines colorimétriques. Biotechnology and Applied Biochemistry, 29 (2), 99-108.
5. Walker, J. M. (Ed.). (mille neuf cent quatre vingt seize). Le manuel des protocoles protéiques (Vol. mille neuf cent quatre vingt seize). Springer Science & Business Media.