Half Löwenstein-Jensen Foundation, préparation et utilisation

Il Middle Löwenstein-Jensen Il s'agit d'un milieu solide sélectif pour l'isolement et le développement des bactéries du genre Mycobacterium, comme Mycobacterium tuberculosis, M. Avium, entre autres, à l'exception des espèces de Leprae, qui n'est pas cultivable.

Les bactéries du genre Mycobacterium ne se développent pas dans les milieux de culture conventionnels, il était donc nécessaire de concevoir un moyen spécial pour son isolement. Le médium d'origine a été créé par Löwenstein et a ensuite été modifié par Jensen.

Demi-Löwenstein-Jensen avec des colonies de Mycobacterium tuberculosis. Source: Agarwal et al / Biomed Central Ltd., Avec l'aimable autorisation de la bibliothèque d'images en biologie

La modification consistait en l'élimination du colorant rouge du Congo, le remplaçant pour une plus grande concentration de malachite vert. Il a également modifié les concentrations de citrate de magnésium et de phosphate monopotasique.

Le milieu Löwenstein-Lose contient actuellement un amidon de papa, Asparragine, Citrate magnétique, phosphate de phase monopo.

Les mycobactéries sont normalement isolées de sites qui ne sont pas stériles, comme les expectorations, l'urine, les abcès, entre autres. Cela signifie que la plupart des échantillons contiendront le microbiote habituel de la région, plus l'agent pathogène.

C'est pourquoi le milieu Löwenstein-Jensen contient une série d'inhibiteurs dans sa composition représentée par la malachite vert, les antibiotiques et les antifongiques.

De plus, les échantillons provenant d'un site non stérile doivent être décontaminés et neutralisés avant d'être semés dans le milieu de Löwenstein-Jensen.

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Base

La présence d'oeuf et de glycérine dans le milieu Löwenstein-Jensen stimule la croissance des mycobactéries car elles fournissent des acides gras et des protéines nécessaires au développement de ces micro-organismes.

Le milieu Löwenstein-Jensen contient du vert malachite, qui est un inhibiteur de microbiote qui l'accompagne. Mais il contient également de l'acide nalidíxique (35 µg / ml), qui inhibe le microbiote Gram négatif, le cycloheximide (400 µg / ml), qui inhibe les champignons de saprophytes et les levures, et le lynchage (2µ / ml).

Certaines maisons commerciales préfèrent ajouter la combinaison suivante d'antibiotiques: Polymixina B 200.000 unités / L, amphotéricine B 10 mg / L, carbénicilline 50 mg / L et trimétoprime 10 mg / L.

Ce milieu ne contient pas d'agar, donc la solidification du milieu se produit par la coagulation de l'albumine présente dans l'œuf pendant la stérilisation.

préparation

Peser 37,3 g du milieu déshydraté dans 600 ml d'eau distillée qui avait déjà été ajoutée 12 ml de glycérol. Le mélange est chauffé, remuant fréquemment jusqu'à sa dissolution totale. Autoclavar le milieu à 121 ° C pendant 15 minutes.

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En revanche, une suspension homogène de 1000 ml d'oeufs frais doit être préparé dans des conditions aseptiques. Ajouter la suspension des œufs à 600 ml préparée à une température de 50 à 60 ° C, en évitant les bulles d'air.

Des solutions antibiotiques sont également ajoutées après stérilisation en autoclave.

Versez le milieu dans des tubes à essai stériles avec un bouchon de filetage. Chauffer les tubes à 85 ° C pendant 45 minutes en position inclinée.

La couleur du milieu préparé est le vert aguamarine et peut présenter des points blanchâtres pour la présence de lipides d'oeufs.

Le pH moyen doit être de 7,2 ± 0,2

Enregistrer les tubes de réfrigérateur et protégé de la lumière directe jusqu'à utiliser. Couler avant de semer.

Il y a une modification du support appelé "modification CRUFT du Löwenstein Jensen". Cela contient les mêmes composés que le milieu classique mais l'ARN-5 mg / 100 ml est ajouté, et en tant qu'inhibiteurs, il contient une malachite verte 0,025 g / 100 ml, pénicilline 50 u / ml et nalidíxico 35 ug / ml d'acide.

Applications

Le milieu Löwenstein-Jensen est utilisé pour l'isolation des mycobactéries, à partir de différents types d'échantillons. Il est recommandé d'effectuer une coloration Ziehl-Neelsen à tout échantillon dans lequel la présence de mycobactéries est suspectée.

Certains échantillons proviennent de sites stériles mais d'autres ne. Les échantillons non stériles doivent être décontaminés comme le cas peut être:

Expectorations

Les échantillons d'expectorations doivent être décontaminés comme suit: Déterminez la quantité d'échantillon d'expectorations en ML et ajoutez à la même quantité de 4% de NaOH et d'incube à 37 ° C.

Secouez le mélange fréquemment sur une période de 30 minutes. Centrifugue par la suite à 3000 tr / min pendant 30 minutes.

Jeter le surnageant sur une solution de désinfectante phénolique. Utilisez les sédiments de semis, mais d'abord le pH doit être neutralisé.

Pour neutraliser les sédiments, h est utilisé₂Swin₄ à 5% en présence de l'indicateur de phénol rouge jusqu'à ce qu'il conduit à un pH neutre qui provient d'une couleur de saumon.

Lavage gastrique, lavage bronchique et aspiration bronchique

Dans ce cas, l'échantillon doit être centrifuge à 3000 tr / min pendant 30 minutes. Le surnageant est jeté et les sédiments sont utilisés. Pour décontaminer les sédiments, 3 ml de NaOH à 4% sont ajoutés et souvent agités à 37 ° C pendant une période d'une demi-heure.

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Centrifugeuse à nouveau, le surnageant est jeté et les sédiments sont utilisés. Ce dernier doit être neutralisé comme expliqué dans l'échantillon d'expectorations.

Urine

Laissez l'échantillon au réfrigérateur pendant 24 heures. Séparer le surnageant. Les sédiments restants doivent être centrifugés pendant 30 minutes à 3000 RMP. Jeter à nouveau le surnageant et reconstituer les sédiments avec 3 ml de solution physiologique stérile.

Ajouter 3 ml de NaOH à 4% et procéder à la décontamination et à la neutralisation comme décrit précédemment.

Liquide ascitique, liquide pleural, liquide céphalorachidien

Dans ce type d'échantillon, il est centrifugé et le surnageant est jeté. Faire un gramme dans les sédiments ou observer directement au microscope; Si les bactéries ne sont pas observées, le passage de la décontamination n'est pas nécessaire et ni la neutralisation.

Dans ce cas, l'échantillon peut être semé directement en utilisant les sédiments. S'il y a des bactéries, procédez à décontaminer et à neutraliser comme décrit ci-dessus.

Biopsies

Ce type d'échantillon doit être ajouté 5 ml d'eau distillée à centrifugeuse à 1500 tr / min pendant 10 minutes. Jeter le surnageant et centrifuger les sédiments à 3500 tr / min pendant 30 minutes. Utilisez les sédiments pour semer le milieu de culture.

Laryngare hiophare

L'écouvillon doit être introduit dans un tube stérile contenant des parties égales d'eau distillée et 4% de NaOH. L'écouvillon doit être pressé sur les parois du tube afin que l'échantillon soit dilué dans le liquide. Centrifuger et utiliser des sédiments. Neutraliser les sédiments comme déjà décrit.

Semé

Les milieux de Löwenstein-Jensen sont inoculés en ajoutant 0,5 ml de l'échantillon à la surface du milieu. Faites pivoter le tube pour distribuer l'échantillon à travers le milieu. Ne portez pas de poignée en platine.

Vous pouvez semer un deuxième tube contenant une demi-pierre afin d'isoler Mycobacterium bovis et d'autres espèces qui ne poussent pas dans l'environnement de Löwenstein-Jensen.

Incubation

Les tubes inoculés sont incubés dans une aérobiose à 37 ° C, avec un couvercle légèrement paresseux et inclinés à environ 5 ° et protégés de la lumière. L'environnement avec du dioxyde de carbone peut être enrichi à 5-10%. Vérifiez les cultures deux fois par semaine jusqu'à l'apparition des colonies.

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Lorsque l'échantillon a été absorbé, les tapas sont ajustées. Le temps d'incubation maximal est de 8 semaines, si après cette période, il n'y a pas de croissance est signalée comme négative.

Contrôle de qualité

En tant que contrôle de la qualité, vous pouvez utiliser les souches suivantes:

Mycobacterium tuberculosis ATCC 27294,  Mycobacterium kansasii ATCC 12478, Mycobacterium avium ATCC 19291, Mycobacterium bovis ATCC 19219, Mycobacterium fortutum ATCC 6841, Escherichia coli ATCC 25922, Streptococcus pyogenes ATCC 19615, Cryptococcus neoformans ATCC 32045

Pour les trois premières espèces mentionnées, un excellent développement est attendu, pour M. Fortuittum La croissance doit être bonne, tandis que pour M. Bovis une croissance rare ou zéro est attendue. Tandis que les espèces autres que le genre Mycobacterium doivent être complètement inhibées.

Limites

Le milieu préparé doit se protéger de l'exposition légère et prolongée à la lumière rend la vire moyenne du vert au bleu, dans ce cas, le milieu ne peut plus être utilisé. C'est parce que le vert de Malachite est photosensible.

Le milieu, tel qu'il contient l'œuf, peut être facilement contaminé s'il n'est pas manipulé aseptiquement. Il peut être dissous s'il est contaminé par des bactéries protéolytiques.

La culture et la manipulation des bactéries du genre Mycobacterium nécessitent du personnel qualifié, qui est conscient des mesures de biosécurité qui doivent être remplies pour éviter d'être contaminées ou contaminées.

Le HCL ne doit pas être utilisé dans le passage de la neutralisation en raison de la formation de chlorure de sodium, qui peut être toxique pour le koch bacillus.

Les échantillons doivent être conservés réfrigérés et protégés de la lumière tant qu'ils ne sont pas traités.

Référence

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