Caractéristiques DAPI (4 ', 6-Diamidino-2-Fenylindol), fondation, utilisation

Il DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phénylindol) C'est un colorant qui, par sa propriété fluorescente, sert de marqueur, étant largement utilisé dans la technique de microscopie à fluorescence ou à cytométrie en flux, entre autres. La fluorescence qu'il émet est bleu vif, son excitation se produit entre 455-461 nm (lumière UV).

Le colorant DAPI peut traverser la membrane cellulaire des cellules mortes avec une grande facilité. Vous pouvez également teindre les noyaux de cellules vivantes, mais dans ce cas, la concentration de ceci doit être plus grande.

Structure chimique de la dyst fluorescente. Source: Image: Fichier: DAPI.SVG est une version vectorielle de ce fichier. Il doit être utilisé à la place de cette image raster lorsqu'il n'est pas inférieur / Richard Wheeler (Zephyris) [CC BY-SA 3.0 (http: // CreativeCommons.Org / licences / by-sa / 3.0 /)] Image édité

Le colorant est capable d'accéder à l'ADN cellulaire à travers lequel il a une affinité spéciale, se joignant à une grande avidité aux bases d'azote de l'adénine et de la thymine. Pour cette raison, il est très utile dans certaines techniques de biologie moléculaire.

Ce composé appartient au groupe de colorants indoliques et a montré qu'il a une plus grande sensibilité à l'ADN que le bromure d'éthidium et l'iodure propideux, en particulier sur les gels d'agarose.

L'utilisation de ce colorant fluorescent est très large, car elle est utile pour: étudier les changements de l'ADN dans les processus apoptotiques (mort cellulaire) et donc détecter les cellules dans ce processus; pour la photo d'empreinte ADN (impression photographique de l'ADN); pour étudier la contamination bactérienne; o Pour visualiser la segmentation nucléaire.

Il a également été utilisé dans l'étude des bandes chromosomiques, dans la détection de l'ADN de Mycoplasmas sp, Dans l'interaction ADN-protéine, dans la coloration et le comptage des cellules par immunofluorescence et même colorier les grains de pollen matures.

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Caractéristiques

DAPI est l'abréviation de son nom chimique (4 ', 6-diamidino-2-phénylindol). Sa formule moléculaire est C₁₆H_quinzeN_5. Il a un poids moléculaire de 350,3. Près de la plage de lumière UV (345 à 358 nm), l'excitation maximale du complexe DAPI-ADN se produit, tandis que l'émission de fluorescence maximale se produit entre 455-461 nm.

Ce colorant est caractérisé par une poussière jaune, mais les structures marquées de ce fluorophore émettent une lumière bleu vif.

C'est un composé soluble dans l'eau, cependant, pour accélérer sa dissolution, une chaleur peut être appliquée. Il peut être dilué avec du PBS mais ne se dissolve pas directement dans ce.

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Une fois le colorant préparé, il doit être stocké dans l'obscurité, c'est-à-dire protégé de la lumière, à une température de 2 à 8 ° C (réfrigérateur). Dans ces conditions, le colorant est stable pendant plus de 3 semaines ou mois.

Si la lumière est protégée, mais sa stabilité est laissée à température ambiante à 2 ou 3 semaines, mais exposée à la lumière directe, la détérioration est très rapide. Si vous souhaitez économiser beaucoup plus longtemps, vous pouvez vous réfrigérer à -20 ° C distribué dans des aliquotes.

Base

Cette coloration est basée sur la génération d'une embauche nucléaire dans les principales techniques de biologie moléculaire, telles que: cytométrie en flux, microscopie à fluorescence et coloration des chromosomes métaphasiques ou noyaux d'interface, entre autres.

Cette technique est basée sur la grande affinité que le colorant a pour les bases azotées (adénine et timin) contenues dans le matériau génétique (ADN) dans la gueule mineure. Tandis qu'au niveau cytoplasmique laisse très peu de fond.

Lorsque l'union du colorant fluorescent aux régions d'adénine et de timina de l'ADN se produit, la fluorescence augmente considérablement (20 fois plus). La couleur qu'il émet est bleu vif. Il convient de noter qu'il n'y a pas d'émission de fluorescence lors de la liaison aux paires de bases GC (guanina-citosine).

Il est important de souligner que bien qu'il ait également une affinité pour l'ARN, il ne cause pas de problème, car le plus grand degré d'émission d'énergie de cette molécule se produit à une autre longueur d'onde (500 nm), contrairement à l'ADN qui le fait à 460 nm. De plus, l'augmentation de la fluorescence une fois liée à l'ARN n'est que de 20%.

Le DAPI est davantage utilisé pour teindre les cellules mortes (fixes) que vous vivez, car pour teindre ce dernier, une concentration beaucoup plus élevée du colorant est nécessaire, c'est parce que la membrane cellulaire est beaucoup moins perméable pour le DAPI lorsqu'elle est vivante.

Le colorant DAPI peut être utilisé en combinaison avec des fluorophores rouges et verts pour obtenir une expérience multicolore.

Utiliser

Le DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phénylindol) est un excellent fluorophore et est donc largement utilisé dans diverses techniques et à diverses fins. L'utilisation de DAPI est expliquée ci-dessous dans les techniques principales.

Cytométrie en flux

Les chercheurs Gohde, Schumann et Zante en 1978 ont été les premiers à utiliser et à proposer le DAPI comme fluorophore dans la technique de cytométrie en flux, ayant un grand succès en raison de leur forte sensibilité par l'ADN et de sa forte intensité dans l'émission de fluorescence.

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L'utilisation de DAPI dans cette technique, permet l'étude du cycle cellulaire, la quantification des cellules et la coloration des cellules vivantes et mortes.

Bien qu'il existe d'autres colorants, tels que le bromure d'éthidium, l'oxyde Hoechst, l'orange acridine et l'iodure de propidio, le DAPI est l'un des plus utilisés pour être plus photoestable que ceux mentionnés ci-dessus.

Pour cette technique, c'est nécessaire. L'échantillon est centrifugé et le surnageant est en train de jeter.

Tandis que le temps passe le colorant DAPI avec un tampon de coloration (Foxp3 de Biolegend) à un 3 µm.

Centrifuguez l'échantillon, jetez le surnageant, puis couvrez ensuite avec 1 ml de solution DAPI pendant 15 minutes à température ambiante.

Apportez l'échantillon au cytomètre en flux avec le laser droit.

Microfluorométrie en flux

Une autre technique dans laquelle le DAPI est utilisé est dans la micro-fluorométrie de l'écoulement avec un autre fluorophore appelé Mitramical. Les deux sont utiles pour quantifier.

Hybridation In situ 

Cette technique utilise essentiellement des sondes d'ADN marquées d'un colorant fluorescent qui peut être le DAPI.

L'échantillon nécessite d'être traité avec de la chaleur pour dénaturer l'ADN à deux classes et le transformer en deux chaînes monocypes. Par la suite, il est hybridé avec une sonde d'ADN dnérée marquée de DAPI qui a une séquence d'intérêt.

Par la suite, il est lavé pour éliminer ce qui n'était pas l'hibride, un contraste est utilisé pour visualiser l'ADN. Le microscope à fluorescence permet l'observation de la sonde hybride.

Cette technique est destinée à détecter des séquences spécifiques dans l'ADN chromosomique, en mesure de diagnostiquer certaines maladies.

Ces techniques cito-moléculaires ont été utiles pour déterminer les détails dans l'étude des caryotypes. Par exemple, il a mis en évidence les régions riches en paires de bases d'adénosine et de thymine appelées régions hétérochromatiques ou bandes DAPI.

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Cette technique est largement utilisée pour l'étude des chromosomes et de la chromatine chez les plantes et les animaux, ainsi que dans le diagnostic des pathologies prénatales et hématologiques chez l'homme.

Dans cette technique, la concentration de DAPI recommandée est de 150 ng / ml pendant un temps de 15 minutes.

Les lames déjà montées doivent être protégées de la lumière à 2-8 ° C.

Coloration de l'immunofluorescence

Les cellules sont fixées avec 4% de paraformaldéhyde. Si d'autres colorants vont être utilisés, DAPI est laissé à la fin comme l'embauche et les cellules avec une solution de PBS pendant 15 minutes sont couvertes. Pendant que le temps s'écoule, préparez la solution DAPI diluant avec du PBS, afin que la concentration finale soit de 300 µm.

Ensuite, l'excès de PBS est extrait et recouvert de DAPI pendant 5 minutes. Laver plusieurs fois. La feuille est observée dans un microscope à fluorescence sous le filtre approprié.

Feuille de sécurité

Ce composé doit être soigneusement manipulé, car c'est un composé qui a des propriétés mutagènes. Le carbone activé est utilisé pour éliminer ce composé de solutions aqueuses qui seront jetées.

Les gants, les robes et les objectifs de sécurité doivent être utilisés pour éviter les accidents avec ce réactif. Si un contact ou un contact muqueux se produit, vous devez laver la zone avec suffisamment d'eau.

Vous ne devez jamais tuer ce réactif avec votre bouche, utiliser des properts.

Ne contaminez pas le réactif avec des agents microbiens, car cela entraînera des résultats erronés.

Ne diluez pas le colorant DAPI plus que recommandé, car la qualité de la coloration diminuera considérablement.

N'exposez pas le réactif à la lumière directe ou ne gardez pas la chaleur car elle diminue la fluorescence.

Les références

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