Chromatographie de colonne

Qu'est-ce que la chromatographie de la colonne?

La Chromatographie de colonne Il s'agit d'une technique qui permet la séparation des composants d'un mélange de substances, afin d'atteindre la purification d'une substance spécifique pour l'identification, la caractérisation ou l'utilisation.

La chromatographie sur colonne a deux phases: une phase stationnaire et une phase mobile. La phase stationnaire peut être trouvée dans une phase solide ou liquide et les substances à séparer interagissent avec elle, précédemment ou simultanément à l'action de phase mobile.

La dégradation des couleurs indique que les substances éluées différemment en raison de leurs variables affinités par la phase stationnaire: la substance bleuâtre, à plus haut, est celle subie par la rétention la plus forte. Source: максим фомич, cc par 2.0, via Wikimedia Commons

La phase mobile, en revanche, se déplace pendant la chromatographie et permet la séparation des composants du mélange. La phase mobile peut être trouvée dans un état liquide ou gazeux et interagit avec des substances en chromatographie de similitude dans leurs polarités.

La chromatographie sur la colonne est une technique polyvalente qui a de nombreuses applications dans diverses industries, ainsi qu'en médecine. Par conséquent, les techniques chromatographiques ont constamment évolué: tel est le cas de la chromatographie liquide à haute résolution (HPLC),.

HPLC permet d'analyser, en très peu de temps, de nombreuses substances, car toutes les étapes du processus sont automatisées. Par exemple, il est très utile dans les symphines d'analyse de la qualité des médicaments, où de nombreux échantillons doivent être analysés quotidiennement.

Nous avons également une chromatographie par exclusion de la taille, qui, comme son nom l'indique, est basée sur la taille des molécules et pas tant sur leurs polarités. Cette technique est utilisée lorsqu'elle est nécessaire pour séparer les mélanges de pigments, de résines, d'asphalte, de biomolécules, etc., qui ne diffèrent pas trop dans leur nature chimique.

Types de chromatographie sur colonne

Il existe plusieurs types de chromatographie qui sont effectués dans une colonne, une structure en verre ou un autre matériau, généralement sous la forme de tubes droits. Parmi les types de chromatographie sur colonne sont les suivants:

• Absorption ou colonne.
• Partition liquide-liquide.
• Échange d'ion.
• Exclusion par taille.
• Gaz.
• Liquide haute résolution (HPLC).
• Affinité.

Fondamentaux et matériaux

Chromatographie de colonne de laboratoire

Chromatographie d'adsorption ou de colonne chromatographie

Cette chromatographie a les mêmes principes que la chromatographie de la couche fine, basée sur l'utilisation d'une phase stationnaire solide de nature polaire (alumine ou gel sylica), et une phase mobile constituée d'un solvant non polaire à l'état liquide.

Les substances polaires présentes dans un mélange de substances interagissent avec la phase stationnaire polaire et sont adsorbés par ce. De plus, ils ont peu d'affinité pour le solvant non polaire de la phase mobile.

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Pendant ce temps, les substances à faible polarité sont facilement séparées de leur union avec la phase stationnaire en raison de leur polarité; ce qui leur permet d'interagir dans une plus grande mesure avec la phase mobile non polaire et d'être déplacé par elle.

Chromatographie de partition liquide-liquide

Ce terme est utilisé pour nommer un type de chromatographie dans lequel la phase stationnaire et la phase mobile sont dans un état liquide. La phase stationnaire est un liquide polaire qui imprègne le support solide, généralement la silice inerte. Et la phase mobile correspond à un liquide non polaire.

Cette disposition de phase en chromatographie de partition est appelée phase normale, tandis que si le liquide non polaire imprègne la silice, constituant la phase stationnaire, elle sera alors appelée chromatographie de partition en phase inverse.

Chromatographie d'échange d'ions

Dans ce type de chromatographie, la phase stationnaire est chargée électriquement. Lorsque votre fardeau est positif, il conserve des anions (-); Et si la charge est négative, aux cations (+).

Ils sont souvent utilisés comme amine à phase stationnaire, acide sulfonique, diatomée, cellulose et sephadex (obtenus à partir de dextrano). Ces derniers matériaux sont ajoutés une charge positive, par exemple, le diéthylamineotil (DEAE) pour obtenir le DEAE-Celulose ou le Deae-Sephadex, pour interagir avec les anions.

Ils peuvent également être ajoutés une charge négative par union du groupe carboxyméthylique (CM), pour former CM-Celulose ou CM-Sephadex, qui fonctionnent comme des échangeurs cationiques.

Les interactions électrostatiques existantes dans ce type de chromatographie peuvent être régulées au moyen de modifications du pH et de la force ionique du liquide qui forme la phase mobile.

PH neutre ou de base, les protéines sont généralement chargées négativement et interagissent avec la charge positive de la Deae-Celulose et du DEAE-Sephadex; Mais en diminuant le pH de la phase mobile, les protéines peuvent devenir positives et arrêter d'interagir avec la charge positive de la phase stationnaire.

En utilisant cette stratégie expérimentale, vous pouvez séparer les différentes protéines présentes dans un mélange.

Ils sont également utilisés dans la chromatographie d'échange d'ions composés inorganiques tels que l'aluminilicatos (zéolittes).

Chromatographie d'exclusion de taille

Ce type de chromatographie est basé sur l'existence de particules que les canaux présentent à l'intérieur, qui permettent la circulation d'une substance de petite taille et de faible poids moléculaire à travers elles. Pendant ce temps, des substances plus grandes ne peuvent pas traverser les canaux et sont exclues d'eux.

Bien qu'il semble étrange, les substances plus grandes se déplacent plus facilement dans la phase mobile que celles de plus petite taille, car elles ne sont pas conservées dans les canaux des particules utilisées en chromatographie. Parmi ces particules se trouvent la zéolite et le sepaadex.

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Le sépadex so-appelé a été créé par la Pharmacia Company du Dextran Polysaccharide. Il existe de nombreux types de sephadex dont l'utilisation est sélectionnée en fonction de la taille moléculaire ou du poids des substances qui sont souhaitées pour séparer.

Chromatographie des gaz

Dans cette chromatographie, la phase stationnaire couvre la paroi des colonnes ou remplissant son intérieur, tandis que la phase mobile est un gaz inerte: azote ou hélium. Les colonnes de chromatographie sont en verre ou en métal; Bien qu'ils aient actuellement des formes étroites de capillaires, dont les murs sont recouverts de silice.

Les colonnes de chromatographie ont une longueur entre 1 mètre et 100 mètres, étant les colonnes à l'intérieur d'un four capable de fournir des températures supérieures à 300 ° C. Les substances utilisées en chromatographie doivent être volatiles, car elles doivent s'évaporer pendant la chromatographie.

Les substances s'évaporent de la surface de la phase stationnaire en fonction de son point d'ébullition. L'évaporation des substances se produit en fonction de l'augmentation de la température du four, permettant aux substances d'atteindre leur point d'ébullition séquentiellement.

Une fois son point d'ébullition atteint, les substances s'évaporent et sont traînées par le courant de gaz inerte vers le système de détection et d'analyse.

La technique de chromatographie en phase gazeuse est essentiellement analytique et non préparative. C'est-à-dire qu'il n'est généralement pas utilisé pour obtenir une certaine substance.

Chromatographie haute résolution (HPLC)

Les fondations HPLC sont similaires à celles appelées colonne ou chromatographie d'adsorption, mais la différence est que le solvant (phase mobile) passe par la phase stationnaire, entraînée par une pression d'environ 400 atmosphères.

Les colonnes HPLC ont une longueur entre 15 et 25 cm et un diamètre interne de 0.46 cm. Ils sont généralement en acier inoxydable. La phase stationnaire est formée par de très petites particules de silice qui ont une caractéristique polaire.

Phase normale

Dans la phase HPLC normale, un solvant non polaire est généralement utilisé comme phase mobile, généralement l'hexane. Les substances polaires interagissent avec la silice et émergent trigly des colonnes de chromatographie. Pendant ce temps, les substances non polaires ont une plus grande affinité pour les solvants non polaires, ils n'interagissent pas avec les particules de silice et émergent donc rapidement des colonnes.

Phase inverse

Dans la phase inverse de So-appelée, les particules de silice polaire sont transformées en non-polaire par l'ajout d'une chaîne d'hydrocarbures de 8 à 18 carbones. Dans la phase mobile, un solvant polaire formé par un mélange de méthanol et d'eau est utilisé.

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Les substances polaires n'interagissent pas avec des particules de silice modifiées (pas polaires) mais interagissent avec le solvant polaire, leur permettant de quitter rapidement la colonne de chromatographie, en étant emmené à un système de détection avec la présence de lumière ultraviolette.

Chromatographie d'affinité

Cette chromatographie est basée sur l'interaction d'une substance particulière avec un ligand pour elle, fixée à un support qui peut être agarsé, dextrano, cellulose, etc. La chromatographie d'affinité est une technique utilisée pour la séparation et la purification des molécules avec une fonction biologique.

La technique de chromatographie sur l'affinité permet la purification d'une protéine, en utilisant un anticorps spécifique fixé à un soutien, qui constitue la phase stationnaire. Le cuivre, le cobalt et le nickel sont utilisés comme ligand pour obtenir des protéines qui contiennent l'acide aminé histidine.

Cette technique de purification de l'ADN et de l'ARN est également utilisée, en utilisant un acide nucléique avec une séquence de base complémentaire. La substance attachée à son ligand peut être séparée en modifiant le pH, ou la force ionique de la solution utilisée comme phase mobile.

Applications

La chromatographie sur colonne est une technique utilisée pour la séparation d'une substance d'un mélange d'entre elles, à des fins ou des objectifs différents. Par exemple: le diagnostic d'un problème, l'identification du médicament, l'obtention d'une substance, etc.

La chromatographie d'adsorption est utilisée dans l'élimination des impuretés de substances, dans l'isolation des métabolites des fluides biologiques, dans la détermination des aliments des acides organiques nocifs, etc.

La chromatographie liquide à haute résolution est une technique qui a de nombreuses utilisations, notamment: dans la détection d'antibiotiques, de sédatifs, de stéroïdes ou d'autres intérêts pharmacologiques; Dans l'identification d'agents polluants tels que les pesticides, les herbicides, les phénols, etc.

La chromatographie en phase gazeuse est utilisée dans l'étude de nombreuses substances volatiles. Il est utilisé dans l'industrie pharmaceutique dans l'analyse des médicaments, comme l'aspirine, l'ibuprofène et le paracétamol. En plus de l'identification dans l'urine des agents de dopage, tels que les amphétamines, la cocaïne, le LSD, le cannabis, etc.

La chromatographie d'exclusion de taille et la chromatographie d'affinité sont principalement utilisées dans l'isolation et la purification des macromolécules biologiques, telles que la protéine et les acides nucléiques.

Et enfin, la chromatographie d'échange d'ions est utilisée dans la purification des protéines et des polypeptides.

Les références

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