Thayer Martin Agar ce que, Fondation, préparation, utilise

Il Thayer Martin Agar C'est un milieu solide très nutritif et sélectif pour l'isolement de Neisseria Meningitidis et Neisseria gonorrhoeae; tous deux connus sous le nom d'importance pathogène ou clinique.

L'une des caractéristiques spéciales les plus importantes présentées par l'agar Thayer Martin est sa teneur élevée dans les suppléments nutritifs. Cette propriété est indispensable, car les neisseries sont des micro-organismes très exigeants du point de vue nutritionnel et ne se développent donc pas dans les médias communs.

D'un autre côté, parce que ces micro-organismes se trouvent normalement dans les zones non séritiles, l'ajout d'inhibiteurs qui empêche la croissance de la flore qui l'accompagne est nécessaire, sans affecter le développement du genre Neisseria.

Cette gélose est composée d'agar de base GC, d'hémoglobine, de suppléments nutritionnels supplémentaires et d'un complexe de substances inhibiteurs (antibiotiques et antifongiques). Les maisons commerciales vendent chacun des suppléments séparément.

L'échantillon à semer dans ce milieu dépendra du micro-organisme qui est recherché. Pour Neisseria gonorrhoeae Les échantillons idéaux sont les sécrétions vaginales et urétrales. Tandis que pour Neisseria Meningitidis Les échantillons les plus utilisés sont le LCR, les exsudats pharyngés et nasopharyngés.

Base

Les Neisseries sont des micro-organismes catalogués comme ennuyeux et donc leur isolement est difficile.  Par conséquent, Thayer Martín est un support complexe et chacun de ses composants remplit une fonction qui est expliquée ci-dessous:

Gélose de base GC

L'agar GC contient la protéine peptone, l'amidon de maïs, le chlorure de sodium, le dipotassium phosphat. Ses composants fournissent des nutriments de base pour le développement microbien, neutralisent les acides gras toxiques, contribuent au maintien de l'équilibre osmotique, à définir le pH et à fournir une cohérence solide à l'environnement.

Hémoglobine

L'hémoglobine fournit des facteurs V et X (nicotinamide adénine dinucléotide NAD et Hemina respectivement). Par conséquent, dans ce milieu, pousse également les espèces de Haemophilus. L'hémoglobine peut être obtenue commercialement déshydratée ou peut ajouter un bovin fraîchement défibiné à l'environnement.

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Complément d'enrichissement

D'un autre côté, le milieu Thayer-Martin doit également être ajouté un supplément d'enrichissement, car les nutriments que l'agar de base contient ne suffit pas pour les exigences du genre Neisseria.

Le supplément d'enrichissement le plus couramment utilisé est appelé isavalex. Cela contient de la glutamine, de l'adénine, du NAD, de la cocarboxylase, de la guanine, du nitrate ferrique, de l'acide p-aminé benzoïque, de la vitamine B12, de la thiamine et du glucose. Tous ces composés sont nécessaires pour le bon développement des neisseries pathogènes.

Inhibiteurs

Parce que ce sont des inhibiteurs de milieu très nutritifs qui empêchent la croissance des micro-organismes de la flore habituelle de la région et favorisent ainsi l'isolement du genre Neisseria.

Le complexe inhibiteur est composé de vancomycine, de colistine et de nistatine. La vancomycine inhibe la croissance des bactéries gram positives, la colistine empêche le développement de bactéries Gram négatives telles que les pseudomonas et certaines neéisses saprophytes, et la nistatine agit sur les levures comme des levures telles que Candida albicans.

Cependant, alors l'agar Thayer Martin a été modifiée; Les changements consistaient en l'ajout de trimetoprime, l'augmentation de la quantité d'agar et l'agrégat de glucose supplémentaire. Ces changements ont considérablement amélioré la récupération de l'espèce de Neisseria gonorrhoeae.

Il convient de noter que le trimetoprime inhibe la croissance du genre protéique et sa formation d'essaimage qui en résulte. En ce sens, les antibiotiques sont ceux qui fournissent le caractère sélectif au moyen Thayer Martin.

préparation

Agar originale de Thayer Martin

-Gélose GC

Peser 8,2 GR du milieu GC déshydraté et suspendre à 100 ml. Mélanger et bouillir pendant 1 minute avec une agitation fréquente pour se dissoudre dans son intégralité. Stériliser le mélange en autoclave à 121 ° C pendant 15 minutes.

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-2% d'hémoglobine

Suspendre 2 gr d'hémoglobine déshydratée dans 2 ou 3 ml d'eau distillée chaude pour former un mélange uniforme. Ajouter progressivement de l'eau pour compléter un volume de 100 ml. La suspension doit être homogène avant de stériliser.

Stériliser en autoclave pendant 15 minutes.

-Complément d'enrichissement

Reconstituer le flacon commercial avec le diluant fourni par la même maison commerciale. Bien mélanger. La quantité de dilue à utiliser sera spécifiée dans l'instruction du kit.

-Supplément d'inhibition V.C.N (Vancomycine, Colistin, Nistatin)

Reconstituer le flacon avec le diluant fourni par la maison commerciale. Bien mélanger. La quantité de dilue à utiliser sera spécifiée dans l'instruction du kit.

-Préparé

Pour les 100 ml d'agar GC, procurez-vous comme suit:

Lorsque l'agar GC quittant l'autoclave, laissez refroidir jusqu'à une température approximative de 50 ° C et ajoutez 2 ml de la solution d'hémoglobine préparée, 2 ml du supplément d'enrichissement (Isoobalex ou Bralex), et 2 ml du supplément d'inhibition. Mélanger et servir dans des assiettes stériles de Pétri.

Laisser solidifier et économiser au réfrigérateur jusqu'à utiliser.

La couleur du milieu préparé est le rouge cerise. Le pH final du milieu est de 7,2 ± 0,2

Thayer Martin Agar a modifié

Peser 8,2 GR du milieu GC déshydraté et suspendre à 100 ml. Ajouter 1 gr d'eau d'agar et ajouter 0,3 gr de glucose. Mélanger et bouillir pendant 1 minute avec une agitation fréquente pour se dissoudre dans son intégralité. Stériliser le mélange en autoclave à 121 ° C pendant 15 minutes.

Préparer l'hémoglobine et le supplément d'enrichissement comme décrit ci-dessus.

Le supplément d'inhibition utilisé est v.C.N.T (vancomycine, colistin, nistatin, trimetoprime).

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-Préparé

Procéder à la manière décrite pour l'agar originale de Thayer Martin.

Utiliser

L'agar de Thayer Martin doit être tempéré avant de semer les échantillons. Les échantillons couramment utilisés sont des exsudats pharyngés, des exsudats nasaux, un vagin, urétral et / ou rectal et CSF.

Utilisez des échantillons fraîchement prélevés et faites de forts inoculums sur l'agar. Les échantillons sont semés directement en raison de la décharge de matériau, puis se sont démarqués en raison de l'épuisement à la surface.

Les plaques sont incubées à 35-37 ° C pendant 24 à 48 heures dans la cruche de microaérophilie (5% de CO₂). Après le temps d'incubation, les plaques sont examinées à la recherche de petites colonies, apparence grise et parfois mucoïde.

Effectuer des tests biochimiques de Gram et confirmatifs aux colonies suspectes.

Contrôle de qualité

Pour effectuer un contrôle de qualité, Thayer Martin peut utiliser les souches microbiennes suivantes.

Neisseria gonorrhoeae ATCC 49226 et Neisseria Meningitidis ATCC 13090; Dans les deux souches, un développement satisfaisant est attendu.

Les souches suivantes doivent également être incluses: Staphylococcus epidermidis ATCC 14990, Escherichia coli ATCC 25922, Proteus mirabilis ATCC 43071 et Candida albicans ATCC 10231. Dans chacun, une inhibition totale ou partielle est attendue dans ce milieu.

Limites

-Gardez à l'esprit que dans les bactéries moyennes résistantes aux inhibiteurs utilisés peut se développer.

-Il y a des souches de Neisseria gonorrhoeae qui peut être sensible à la concentration de vancomycine utilisée. Pour cette raison, il est recommandé d'utiliser une gélose au chocolat parallèle complétée par Isovalex, mais sans inhibiteurs.

-Il existe des souches de levure résistantes à la nistatine qui peuvent se développer dans ce milieu et interférer avec l'isolement des néisseries pathogènes, en particulier les gonocoques.

Les références

1. Laboratoires britanniques. Thayer Martin Media a modifié. Disponible sur: Britanialab.com