Fondation standard du nombre d'agar, préparation et utilisations

Il standard d'agar Il s'agit d'un milieu de culture solide et non sélectif, conçu pour la quantification de la charge microbienne aérobie présente dans les eaux de consommation, les eaux usées, les boissons laitières, entre autres aliments. Ce support est également connu sous le nom d'agar PCA) pour son acronyme dans l'agar du nombre de plaques anglaises. Il a été créé en 1953 par Buchbinder, Baris et Goldstein.

Le milieu du compte standard est composé d'extrait de levure, de tritutéine, de glucose, d'agar et d'eau distillée. Cette formulation contient des éléments de base nutritionnels qui permettent le développement de la charge microbienne aérobie actuelle et non exigeante.

Dilutions décimales pour le nombre de standard de comptage UFC. Source: Quentin Geissmann [CC BY-SA 3.0 (https: // CreativeCommons.Org / licences / by-sa / 3.0)]

Comme le milieu ne contient pas d'inhibiteurs, les bactéries peuvent se développer sans aucune restriction, il est donc idéal pour le nombre de colonies générales. Cependant, la technique de quantification de la plaque ne détectera pas toutes les bactéries présentes, mais seulement celles qui sont capables de se développer dans les conditions environnementales auxquelles l'agar est soumise.

En ce sens, la technique de quantification de la plaque est généralement déterminée par la quantité de bactéries de type mésophile aérobie, c'est-à-dire celles qui sont développées à des températures comprises entre 25 et 40 ° C, avec une température de croissance optimale à 37 ° C.

Ce groupe bactérien est très important, car il existe la plupart des bactéries pathogènes pour l'homme.

Il convient de noter que parfois les intérêts quantifient la quantité de bactéries psychrophiles présentes dans la nourriture. Ces bactéries sont celles qui se développent à basse température (< 20°C) y son las responsables de que los alimentos se descompongan más rápido, aun estando en nevera.

De même, les bactéries thermophiles, qui se développent dans une plage entre 50 ° C à 80 ° C ou plus, peuvent être importantes dans certains types d'aliments tels que la conserve.

La quantification microbienne est exprimée dans les unités de formation du côlon (UFC) par gramme ou un millilitre d'échantillon.

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Base

Le compte standard est conçu pour permettre le développement satisfaisant de bactéries aérobies non exigeantes, car l'extrait de levure, la tritéine et le glucose fournissent les nutriments nécessaires pour un bon développement microbien.

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D'un autre côté, le milieu a une couleur claire et une apparence transparente, il est donc idéal pour la visualisation des colonies développées par la méthode semée en profondeur (déversement de plaque).

Ce sont également des colonies possibles comptant par la méthode plantée de surface avec Drigalski Spatule.

Lorsque la charge microbienne est élevée, les dilutions décimales de l'échantillon à l'étude doivent être faites pour pouvoir effectuer le nombre d'UFC.

Il convient de noter que ce support est recommandé par l'American Public Health Association (APHA) pour le nombre de messophiles aérobies.

préparation

Peser 23,5 gr du milieu déshydraté et se dissoudre dans un litre d'eau distillée. Pour se dissoudre complètement, le mélange doit être chauffé en agitant fréquemment jusqu'à ce qu'il bouiltre. Les étapes suivantes dépendent de la technique plantée qui sera utilisée.

Pour la technique du déversement de plaque

Distribuez en donnant 12 à 15 ml dans les tubes à essai. Par la suite, stérilisez en autoclave à 121 ° C pendant 15 minutes. Laisser se solidifier verticalement sous la forme d'un taco. Enregistrer jusqu'à utiliser.

Faire fondre le taco quand il sera utilisé. Une fois que vous pouvez le garder à Maria à 44-47 ° C pendant que les échantillons sont préparés.

Pour la surface semée

Stériliser le milieu en autoclave à 121 ° C puis distribuer 20 ml dans des plaques stériles de Petri. Laisser solidifier, investir et économiser dans le réfrigérateur jusqu'à utiliser.

Tempéter les plaques avant d'utiliser. Le pH moyen doit être de 7,0 ± 0,2.

Utiliser

Le compte standard est utilisé dans la technique de comptage mésophile aérobie pendant l'analyse microbiologique de l'eau et de la nourriture. Le récit des mésophiles aérobies est nécessaire, car il détermine la qualité de santé de l'échantillon à l'étude.

L'application de cette technique (en utilisant ce support) permet la visualisation macroscopique des colonies isolées pour la quantification.

Technique de décharge de plaque (semée en profondeur)

-Procédure

La technique se compose des éléments suivants:

1) homogénéize l'échantillon afin de redistribuer les bactéries présentes.

2) Une suspension initiale est effectuée dans une bouteille ou un sac stérile, concernant le rapport 10 GR ou 10 ml dans 90 ml de diluant (10^-1).

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3) À partir de la suspension initiale, les dilutions décimales pertinentes sont faites en fonction du type d'échantillon. Ex: (10^-2, dix^-3, dix^-4). Les dilutions sont effectuées avec de l'eau peptonada ou une solution tampon de phosphate.

Pour ça^-2 et ainsi de suite.

4) 1 ml de chaque dilution est prise et placée sur des plaques de pétrie stériles vides.

5) Ajouter à chaque plaque 12 à 15 ml d'agar auparavant fondu et reposé à 44 - 47 ° C.

6) Donner des mouvements rotatifs doux aux plaques pour distribuer l'échantillon à côté de l'agar uniformément et laisser se solidifier.

7) Investissez les plaques et incubez à 37 ° C dans une aérobiose pendant 24 à 48 heures.

8) a culminé le temps à examiner les plaques et à compter les colonies de la dilution qui lui permet. Les plaques qui ont entre 30 et 300 UFC sont choisies pour le compte.

Le nombre peut être fait manuel ou peut utiliser l'équipe de comptable de Colony.

Les valeurs autorisées par ML de l'échantillon peuvent varier d'un pays à l'autre selon les règles par lesquelles elles sont régies.

-Calcul de l'UFC

Le calcul général est effectué en utilisant la formule suivante:

Formule pour le calcul général de la quantification de l'UFC. Source: National Drug Administration and Medical Technology (ANMAT). Analyse microbiologique des aliments, méthodologie analytique officielle, micro-organismes indicateurs. Volume 2014 3. Disponible sur: Anmat.Gouvernement.ardente

Exprimer les résultats en 1 ou 2 chiffres, en multipliant par la base appropriée 10. Exemple: si le résultat est 16.545 est arrondi en fonction du troisième chiffre à 17.000 et sera exprimé comme suit: 1,7 x 10⁴. Maintenant, si le résultat était 16.436 est arrondi à 16.000 et exprime 1.6 x 10⁴.

Technique de surface semée

-Procédure

-Inoculer avec 0,1 ml de l'échantillon direct s'il est liquide, suspension initiale 10^-1 ou de dilutions consécutives 10^-2, dix^-3 etc, au centre d'une plaque de compte standard.

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-Distribuez l'échantillon avec la spatule Drigalski ou la tige de verre sous la forme de L. Laisser reposer 10 minutes.

-Investissez les plaques et incubez dans l'aérobiose à 37 ° C pendant 24 à 48 heures.

-Procéder à compter les colonies, choisissez les plaques qui se trouvent entre 20 et 250 UFC.

-Calcul de l'UFC

Pour le calcul, le facteur de dilution est appliqué, qui est l'inverse. Le nombre à 2 chiffres significatifs est arrondi (arrondi selon le troisième chiffre) et est exprimé en puissance de base 10. Par exemple, si 224 UFC sont comptés dans l'échantillon sans dilution (10^-1), 22 x 10 est signalé¹  UFC, mais si le chiffre était 225, il est signalé 23 x 10¹ UFC.

Maintenant, si 199 UFC sont comptés dans la dilution 10^-3, 20 x 10 seront signalés⁴ UFC, mais si 153 UFC sont comptés dans la même dilution seront signalés 15 x 10⁴ UFC.

Contrôle de qualité

Le support de compte standard peut être évalué à l'aide de souches connues certifiées, telles que: Escherichia coli ATCC 8739, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Bacillus subtilis ATCC 6633, Lactobacillus fermentum ATCC 9338, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Shigella flexneri ATCC 12022.

Si le milieu de culture est dans des conditions optimales, une croissance satisfaisante est attendue dans tous les cas, à l'exception de L. Fermentum qui peut avoir des performances régulières.

Pour évaluer la stérilité du milieu de culture, une ou deux plaques de chaque lot préparé (sans inoculation) à 37 ° C en aérobiose pendant 24 heures doivent être incubé. Après ce temps, aucune croissance ou changement de couleur du milieu ne doit être observé.

Limites

-Ne fait pas fondre l'agar plus d'une fois.

-Le milieu préparé peut durer jusqu'à 3 mois tant qu'il reste dans un réfrigérateur et protégé de la lumière.

-Ce médium ne convient pas aux micro-organismes exigeants ou aux anaérobies.

Les références

1. Administration nationale des médicaments alimentaires et technologies médicales (ANMAT). Analyse microbiologique des aliments, méthodologie analytique officielle, micro-organismes indicateurs. Volume 2014 3. Disponible sur: Anmat.Gouvernement.ardente
2. Laboratoires Diffco Francisco Soria Melguizo, S.POUR. Agar du comptage des plaques. 2009. Disponible sur: http: // f-Soria.est
3. Conda pronadisa Laboratories. Agar pour les méthodes standard (PCA) selon APHA et ISO 4833. Disponible sur: condalab.com
4. Laboratoires britanniques. Nombre de plaques d'agar. 2015. Disponible sur: Britanialab.com
5. Camacho A, Giles M, Ortegon A, Palao M, Serrano B et Velázquez ou. 2009. Techniques d'analyse microbiologique alimentaire. 2e édition. Faculté de chimie, Unam. Mexique. Disponible sur: DEPA.Finesse.Unam