Caractéristiques de la protéinase K, activité enzymatique, applications

La protéine k C'est une enzyme qui appartient au groupe de sérine protéases, c'est-à-dire qu'il a dans son centre catalytique actif un acide aminé de sérine et a la fonction de briser les liaisons peptidiques par hydrolyse. À son tour, cette enzyme appartient à la famille des protéines de subtilisine (peptidase S8).

La k protéinase a un poids moléculaire (PM) de 28.900 daltons et a été isolé pour la première fois dans 1.974 dans les extraits de champignons Album d'Engyodontium, précédemment connu comme le nom de Album Tritirachium Limber.

Structure moléculaire de la k protéinase. Source: Lykchiniadis [CC BY-SA 4.0 (https: // CreativeCommons.Org / licences / by-sa / 4.0)]

Il présente une capacité protéolytique élevée, démontrée en étant capable de dégrader la kératine présente dans les cheveux. Le mot kératine en anglais est écrit "kératine", à partir de là, il vient qu'il a été appelé "Proteinsa K".

En raison de sa puissance élevée pour diviser les protéines natives, cette enzyme est utile dans diverses techniques de biologie moléculaire. Principalement utilisé pour isoler et préparer les acides nucléiques avec un poids moléculaire élevé (PM).

La k protéinase K agit en libérant l'ADN nucléaire, tout en détruisant des protéines et inactifs aux RNases et au DNAT, c'est-à-dire élimine les nucléas dans les préparations d'ADN et d'ARN.

D'un autre côté, il a été constaté que la k protéinase peut hydrolyser certaines protéines indigènes dénaturées, ce qui a rendu l'intérêt des chercheurs à utiliser dans l'étude des protéines prions (PRPC).

Cependant, malgré sa puissance protéolytique élevée, il existe des protéines résistantes à l'action de la protéine k. Parmi eux, il existe certaines protéines anormales appelées prions (PRPSC), associées à des encéphalopathies spongiformes transmissibles.

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Caractéristiques de la protéinase k

La k protéinase a une structure tertiaire composée de trois couches, avec une feuille β de sept chaînes médicales entre deux couches d'hélices. Pour appartenir à la famille des peptidases S8 se caractérise par la présentation d'une triade catalytique dans son site actif, dont l'ordre séquentiel est (asp, son et être), qui les différencie des autres familles de peptidase.

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Cette enzyme du groupe de sérine protéase se caractérise par l'hydrolyzage des liaisons peptidiques proches du groupe carboxylique d'acides aminés aliphatiques et aromatiques.

D'un autre côté, il est capable d'agir en présence de certaines substances corrosives, telles que le dodécilfate de sodium (SDS), le Tris-HCl et l'EDTA, qui sont utilisés pour aider à la dénaturation des protéines, ce qui les oblige à perdre leur structure indigène.

Il s'agit d'une étape précédente dans la préparation des protéines pour la technique de l'électrophorèse. La plage de pH à laquelle agit la protéinsa k est assez large (2.0 à 12.0), avec un pH optimal entre 7.5 à 12.0, et son point isoélectrique est 8.9. Comme on peut le voir, il est actif contre une très large gamme de pH.

Une autre caractéristique qui se démarque dans la protéinase K est sa stabilité en présence de températures élevées (50 - 60 ° C).

Activité enzymatique

La k protéinsa a besoin de la présence d'ions calcium, bien qu'il n'affecte pas son activité, s'il est essentiel pour maintenir sa stabilité.

Pour que la k protéinsa pour effectuer la digestion complète du substrat, un temps de contact approximatif est nécessaire entre 5 minutes et 2 heures.

Cependant, dans ce sens, Daza et les collaborateurs ont comparé la pureté de l'ADN obtenu à plusieurs temps d'exposition à la protéinase K, et a conclu qu'une incubation prolongée (jusqu'à 24 h) améliore considérablement la qualité de l'ADN.

Maintenant, par rapport à la concentration utilisée de l'enzyme de K protéinase K dans les différents protocoles, on peut dire qu'il est très varié.

Il peut être utilisé à partir de très faibles concentrations (5 µg / ml) à 500 µg / ml de concentrations. Mais les concentrations de travail les plus fréquentes se situent entre 50 et 100 μg / ml, en particulier pour la digestion des protéines et les nucléas. Bien que pour le traitement tissulaire, une concentration de 2 mg / ml soit requise.

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Applications

Leurs applications sont très larges et peuvent être résumées dans ce qui suit:

-Il est utilisé dans la digestion des protéines et l'extraction de l'ADN par plusieurs méthodes telles que: le salting-out, le PK-SDS, le cétyl-trityl-ammonium (CTAB), l'acétate de potassium modifié et l'acétate d'extraction d'iodure de sodium.

-Inactivation des nucléasas (RNASAS et DNASAS).

-Dans la technique d'hybridation In situ (Sien), pour aider la libération d'acide nucléique, en plus d'éliminer les protéines indésirables.

-Modification des protéines.

-Au niveau de la recherche, dans diverses études.

Avantages de la k protéinase

Diverses études comparatives ont été menées entre des techniques d'extraction d'ADN qui utilisent la k protéinase, avec d'autres qui ne l'utilisent pas et tous concluent qu'il y a de plus grands avantages lorsque l'enzyme est utilisée. Parmi les avantages, les éléments suivants peuvent être mentionnés:

-L'ADN à haute qualité moléculaire, de haute qualité et de pureté est obtenu.

-L'ADN extrait est stable jusqu'à 3 mois.

L'ADN extrait peut être utilisé dans les techniques suivantes: blot sud, réaction en chaîne en polymérase (PCR), électrophorèse, entre autres.

Protéines k résistantes à la protéinase

Diverses investigations ont conclu que les prions (les protéines anormales PrPSC toxiques diffèrent des protéines PRPC (natives) en étant résistante à l'action de la protéinase K, tandis que les PRPC sont sensibles à leur action.

D'autres auteurs ont décrit que dans la structure du PRPSC, il existe des parties sensibles et d'autres résistantes à la protéinase k. Cependant, les deux parties sont tout aussi toxiques et contagantes.

D'un autre côté, Bastian et les collaborateurs en 1987 ont isolé 4 protéines de 28, 30, 66 et 76 kDa à partir d'une sorte de Spiroplasma mirum. Tout s'est avéré résistant à l'action de la protéinase K et a également eu une réaction croisée avec certains prions.

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Il est connu que cette espèce peut provoquer des cataractes importantes et des dommages neurologiques et en raison des résultats scientifiques de Bastian, entre autres recherches, il a tenté de se rapporter à ce micro-organisme avec des encéphalopathies spongiformes transmissibles transmissibles transmissibles transmissibles transmissibles transmissibles transmissibles transmissibles transmissibles transmissibles transmissibles transmissibles transmissibles transmissibles transmissibles transmissibles.

Cependant, l'étiologie de cette pathologie neurologique dégénérative reste actuellement attribuée aux prions.

En ce sens, le majordome et les collaborateurs en 1991 ont identifié et caractérisé une classe d'une protéinase KDA de 40 kDa à deux souches de deux souches de Mycoplasma hyorhinis. Ce pathogène affecte les porcs, infectant leurs tissus, mais dans ce cas, il n'y a pas eu de réaction croisée avec les prisons testées.

Des recherches supplémentaires sont nécessaires pour élucider de nombreuses inconnues à cet égard.

Les références

1. Bastian F, Jennings R et Gardner W. 1987. Antisérum à la protéine de fibrille asocied à grabin Spiroplasma Mirum Protéines fibrilles. J. Lutter. Microbiol. 25: 2430-2431.
2. Daza C, Guillen J, King J, Ruiz V. Évaluation d'une méthode d'extraction et de purification d'ADN à partir de tissu musculaire fixé dans le formaldéhyde de cadavres non identifiés.  Médicament, 2014; 22 (1): 42-49,
3. Butler G, Kotani H, Kong L, Frick M, Evancho S, Stanbridge E et McGarrity G. Identification et caractérisation des protéines résistantes aux protéines K chez les membres de la classe mollicutes.  Infection and Immunity, 1991, 59 (3): 1037-1042
4. López M, Rivera M, Viettri M, Lares M, Morocoima A, Herrera L, et al. Comparaison de deux protocoles d'extraction d'ADN de Trypanosoma cruzi cultivé en milieu axhénique. Tour. Pérou. Médicament. Exp. Santé publique  2014; 31 (2): 222-227. Disponible sur: SCIELO.org
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