ADN recombinant technique, applications et principes fondamentaux

Il ADN recombinant (ADN ou ADNr) est une molécule d'acide nucléique artificielle créée en laboratoire, en intégrant deux segments d'organisme d'intérêt. Il est également connu sous le nom d'ADN chimérique, grâce à sa propriété hybride. Nous ne trouvons pas ce type d'ADN dans la nature.

La méthodologie de base pour le générer comprend: (a) la sélection d'un ADN blanc et son insertion dans un autre fragment d'ADN (généralement un plasmide bactérien); (b) l'introduction de ce plasmide dans une bactérie, (c) la sélection des bactéries par des antibiotiques et enfin (d) l'expression du gène.

Source: Pixabay.com

La technique tire parti d'un jeu enzymatique qui vous permet de copier et coller des fragments d'ADN spécifiques à l'essai du chercheur.

El objetivo de la tecnología recombinante es, en la mayoría de los casos, la expresión de una proteína (conocida como proteína recombinante) deseada por el biólogo molecular para futuras investigaciones o para crear una proteína de valor comercial y terapéutico - como la insulina humana, par exemple.

[TOC]

Fondamentaux de la technique d'ADN recombinant et son utilisation en génie génétique

Le dogme central de la biologie moléculaire

Tous les êtres biologiques que nous connaissons partagent plusieurs caractéristiques. L'un d'eux est la nature du matériel génétique et la façon dont les protéines sont produites - procédé connu sous le nom de «dogme» central de la biologie moléculaire.

À l'exception d'une paire de virus, tous les organismes stockent des informations génétiques dans l'ADN (acide désoxyribonucléique), collecté très compact et organisé dans le noyau cellulaire.

Pour l'expression des gènes, la molécule d'ADN est transcrite à l'ARN messager, et ce dernier est traduit en langage d'acide aminé, les blocs structurels des protéines.

Qu'est-ce qu'un ADN recombinant?

Entre les années 70 et 80, les biologistes moléculaires ont commencé à profiter des processus qui se produisent naturellement à l'intérieur de la cellule et ont réussi à les extrapoler au laboratoire.

De cette façon, un gène animal (un vertébré, par exemple) pourrait être inséré dans un segment d'ADN à partir d'une bactérie; ou l'ADN d'une bactérie pourrait être combiné avec un ADN viral. Ainsi, nous pouvons définir un ADN recombinant comme une molécule composée d'ADN de deux organismes différents.

Une fois cette molécule hybride ou recombinante créée, nous procédons à l'expression du gène d'intérêt. Avec le mot expression Nous voulons nous référer au processus de traduction des protéines.

Peut vous servir: monohíbrid

ENZYMES DE RESTRICTION ET LEGUES: La clé du processus

Un élément clé pour développer la technologie d'ADN recombinant a été la découverte des enzymes de restriction.

Ce sont des molécules de protéines qui présentent la capacité de se diviser en ADN (nucléas) dans des séquences concrètes, servant de "ciseaux moléculaires". Les fragments générés par ces enzymes sont appelés fragments de restriction.

Ces enzymes peuvent produire dans la séquence blanche des coupes symétriques (dans les deux chaînes à la même hauteur) ou des coupes asymétriques. Un aspect clé de l'action des enzymes de restriction est qu'après le fractionnement des chaînes, un "bord lâche" est obtenu, complémentaire à l'autre bord coupé par la même enzyme.

Certains exemples sont ECOR 1 et SMA 1. Plus de 200 types d'enzymes de restriction sont actuellement connus et ils sont disponibles dans le commerce.

Pour être utile, un ciseaux doit être accompagné de la colle. Cette action de scellage d'ADN (traitée précédemment avec des enzymes de restriction) est réalisée par des ligues.

Technique: comment est l'ADN d'un organisme en laboratoire modifié artificiellement?

Ensuite, nous décrirons les principales étapes requises par la technologie d'ADN recombinante. Tous sont réalisés par des professionnels d'un laboratoire de biologie moléculaire.

Qu'est-ce qu'un "clone"?

Avant de continuer avec le protocole expérimental, nous devons remarquer que dans la biologie moléculaire et la biotechnologie, le terme "clone" et le verbe "clonar" sont largement utilisés. Cela pourrait conduire à la confusion.

Dans ce contexte, nous ne faisons pas référence au clonage de tout un organisme (comme dans le cas du célèbre Dolly Sheep, par exemple), mais au clonage d'un fragment d'ADN, qui peut être un gène. C'est-à-dire produire de nombreuses copies - génétiquement identiques - de la séquence.

1. Isolement et obtention de l'ADN

La première étape consiste à décider quelle séquence souhaite être utilisée. Cela dépend totalement du chercheur et des objectifs de son travail. Ensuite, cet ADN doit être isolé et purifié. Les méthodes et procédures pour y parvenir dépendent de l'organisme et du tissu.

Une partie du tissu est généralement prise et subit un traitement dans un buff de lyse. Par la suite, la fragmentation du matériel génétique dans les petits fragments.

2. Vecteur de clonage

Après les étapes préparatoires, le chercheur cherche à introduire le segment d'ADN d'intérêt dans un vecteur de clonage. Désormais à ce segment d'ADN, nous l'appellerons ADN blanc.

Il peut vous servir: gène dominant: principes génétiques, méthodes d'étude, facteurs

Plasmides

L'un des vecteurs les plus utilisés dans un plasmide d'origine bactérienne. Un plasmide est une molécule d'ADN circulaire à double chaîne que nous trouvons naturellement dans les bactéries. Ce sont des entités en dehors du chromosome bactérien - c'est-à-dire qu'ils sont extracromosomiques et se trouvent naturellement dans ces procaryotes.

Les éléments de base d'un vecteur sont: (a) une origine de la réplication, qui permet la synthèse de l'ADN; (b) agent de sélection, qui permet d'identifier les organismes qui transportent le plasmide avec l'ADN blanc, comme la résistance à un antibiotique; et (c) le site de multiclonation, où les séquences qui seront reconnues par des enzymes de restriction sont trouvées.

Le premier ADN recombinant réussi en laboratoire a été cloné dans le plasmide PSC101 des bactéries ET. coli. Il contient un site de restriction pour l'enzyme de restriction ECORI et un gène de résistance à un antibiotique, en plus de l'origine de la réplication.

L'insertion de l'ADN blanc dans le plasmide se fait en utilisant les outils moléculaires des enzymes et des ligues de restriction décrites dans la section précédente.

Types de vecteurs importants

En plus des plasmides, l'ADN peut être inséré dans un autre vecteur, comme le bactériophage lambda.

3. Introduction de l'ADN recombinant

Une fois que la molécule d'ADN recombinante (gène d'intérêt pour le plasmide ou un autre vecteur) a été obtenue.

Pour introduire l'ADN étranger dans une bactérie, une technique appelée transformation bactérienne est utilisée, où le corps est soumis à un traitement avec des cations divalents qui le rend sensible à la prise d'ADN.

Méthodologiquement, nous ne pouvons pas nous assurer que 100% des bactéries de notre culture ont effectivement pris notre molécule d'ADN recombinante. C'est là que la partie du plasmide qui contient une résistance aux antibiotiques entre en jeu.

Ainsi, les bactéries qui ont pris le plasmide seront résistantes à un certain antibiotique. Pour les sélectionner, ce sera suffisant pour l'application dudit antibiotique et prenez les survivants.

4. Protéine "récolte"

Après avoir sélectionné des bactéries avec notre ADN recombinant, nous utilisons la machinerie enzymatique de l'hôte pour générer le produit protéique d'intérêt. Au fur et à mesure que les bactéries sont reproduites, le plasmide passe à sa progéniture, il n'est donc pas perdu pendant la division.

Cette procédure utilise les bactéries comme une sorte d '«usine» de protéines. Plus tard, nous verrons que cela a été une procédure très pertinente dans le développement de traitements médicaux efficaces.

Peut vous servir: télophase: ce qui est, en mitose, en méiose

Une fois la culture prête et que les bactéries ont produit de grandes quantités de protéines, la cellule ou la rupture de la cellule est. Il existe un large éventail de techniques biochimiques qui permettent la purification des protéines en fonction de leurs caractéristiques physiques.

Dans un autre contexte expérimental, nous ne sommes peut-être pas intéressés à générer des protéines, mais nous souhaitons obtenir la séquence d'ADN en soi. Si c'était le cas, le plasmide servirait à la création de plusieurs copies du fragment qui nous intéresse dans le but d'avoir une quantité suffisante d'ADN blanc pour effectuer les expériences pertinentes.

Applications

La technologie d'ADN recombinante a ouvert un nombre infini de possibilités de biologie moléculaire, de biotechnologie, de médecine et d'autres domaines connexes. Vos applications les plus remarquables sont les suivantes.

Analyse génétique

La première application est directement liée aux laboratoires de biologie moléculaire. La technologie d'ADN recombinante permet aux chercheurs de comprendre la fonction normale des gènes et les protéines générées peuvent être utilisées dans la recherche ultérieure.

Industrie pharmaceutique

Les protéines produites en utilisant la procédure d'ADN recombinante ont des applications en médecine. Deux exemples très pertinents dans le domaine sont l'insuline humaine et l'hormone de croissance, qui est appliquée chez les patients dépourvus de telles protéines.

Grâce à l'ADN recombinant, ces protéines peuvent être générées sans avoir besoin d'extraire d'un autre être humain, ce qui représente des complications méthodologiques supplémentaires et des risques pour la santé. Cela a contribué à améliorer la qualité de vie d'innombrables patients.

Les références

1. Baca, L. ET. L., & Álvarez, C. L. C. (2015). Biologie 2. Groupe éditorial de Patria.
2. Cooper, G. M., Hausman, R. ET., & Hausman, R. ET. (2000). La cellule: une approche moléculaire (Vol. dix). Washington, DC: ASM Press.
3. Devlin, t. M. (2004). Biochimie: manuel avec applications cliniques. J'ai inversé.
4. Khan, s., Ullah, m. W., Siddique, R., Nabi, g., Manan, s., Yousaf, m., & Hou, h. (2016). Rôle de la technologie d'ADN recombinant pour améliorer la vie. Journal international de génomique, 2016, 2405954.
5. Mindan, F. P., & Mindan, P. (mille neuf cent quatre vingt seize). Anatomie pathologique. Else de l'Espagne.
6. Tortora, G. J., Funke, B. R., & Case, C. L. (2007). Introduction à la microbiologie. Élégant. Pan -American Medical.
7. Eux. J. (1989). Insuline humaine: le premier médicament de la technologie ADN. American Journal of Health-System Pharmacy, 46(11_Suppl), S9-S11.